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新蛭素和人IgG-Fc融合蛋白的表达纯化和功能评价
【作者】吴祖泽 汪坤 李世崇 董晓娜 窦桂芳 葛志强 靳继德
【关键词】 水蛭素; 新蛭素; 抗凝活性; 半衰期; Fc融合蛋白;
【摘要】新蛭素（EH）具有很好的抗凝血效果,但由于半衰期短限制了其在临床上的推广和应用.为延长EH的半衰期,制备人Ig G-Fc和EH的融合蛋白,并对其活性和药代动力学进行初步研究.将合成的Fc-EH和Fc-L-EH融合基因克隆至表达载体pc DNAHC上,再将重组表达载体转染CHO细胞.蛋白A亲和柱纯化融合蛋白,用SDSPAGE和WesternBlot鉴定蛋白表达情况,质谱法检测蛋白的分子质量和C端序列,体外凝块法和大鼠颈静脉血栓模型分别验证融合蛋白的体外抗凝活性和体内抗栓效果,应用化学发光免疫法检测融合蛋白半衰期.结果表明,成功构建了pc DNAHC-Fc-EH和pcDNAHC-Fc-L-EH两个重组表达载体,融合蛋白Fc-EH和Fc-L-EH分子质量分别为68 476,u和70 542,u,蛋白的C端序列正确,Fc-EH和Fc-L-EH活性分别为256,ATU/mg和64,ATU/mg.大鼠颈静脉血栓实验表明,Fc-EH具有抗血栓作用,体内消除半衰期为39.4,h.融合蛋白Fc-EH能延长EH体内半衰期,为融合蛋白的进一步研究奠定了基础.
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